Clodronate Liposomes如何使用的相關(guān)問(wèn)題解答

    2018年蘇州螞蟻淘生物科技有限公司正式成為Clodronate liposomes的授權代理商，負責該公司巨噬細胞清除試劑在中國大陸的市場(chǎng)和銷(xiāo)售工作，此前使用的是陳舊的資料，今天螞蟻淘重新整理了一份Clodronate liposomes說(shuō)明書(shū)，以FAQS的形式展示如下：



1、是否有可能在體外使用氯膦酸脂質(zhì)體清除巨噬細胞?

    是的，在體外消耗巨噬細胞是可能的，但請記住，這種方法特別適用于“體內”研究。原因是Clodronate從死qu的巨噬細胞釋放或泄漏培養基中發(fā)布的脂質(zhì)體(依賴(lài)于介質(zhì)的組成)不能逃離媒介而Clodronate,一旦“體內”發(fā)布,半衰期很短,由于其快速切除腎臟。游離氯膦酸鹽分子不容易進(jìn)入細胞，因為它們很難通過(guò)細胞膜(以及脂質(zhì)體磷脂雙層膜)。然而，如果它們留在周?chē)呐囵B基中，它們可能會(huì )慢慢積累成細胞。

    參見(jiàn)參考文獻Claassen, I., Van Rooijen, N., and Claassen, E., 1990. A new method for removal of mononuclear phagocytes from heterogenous cell populations ‘in vitro’, using the liposome-mediated macrophage ‘suicide’ technique. J. Immunol. Meth.. vol. 134. pp. 153-161. (#32).

 

2、清除肺泡巨噬細胞如何給藥？

    脂質(zhì)體既可經(jīng)鼻給藥，也可經(jīng)氣管給藥。

    參見(jiàn)參考文獻：DeHaan, A., Groen, G., Prop, J., Van Rooijen, N., Wilschut, J. 1996. Mucosal immunoadjuvant activity of liposomes: Role of alveolar macrophages. Immunology, 89; 488-493)
The difference may be that all liposomes once admiNISTered intratracheally, arrive in the lung (alveoli), whereas liposomes admiNISTered intranasally (if admiNISTration is not well performed

 

3、動(dòng)物注射氯膦酸脂質(zhì)體后死亡的原因？

    A、動(dòng)物在注射過(guò)程中死亡

    這可能是由于注射了非均勻懸浮的脂質(zhì)體。

    為了得到均勻的懸浮體，在注射前應搖動(dòng)或攪拌脂質(zhì)體的懸浮體。一段時(shí)間后脂質(zhì)體會(huì )沉淀。如果注射時(shí)間太長(cháng)，它們甚至可能沉淀在注射器中，如果更多的動(dòng)物使用相同的注射器注射，這也可能導致不同的劑量，因為個(gè)動(dòng)物將得到更多的(部分沉淀)脂質(zhì)體比后一個(gè)動(dòng)物。

    另一個(gè)原因可能是注射過(guò)快。如果從冰箱中取出脂質(zhì)體，它們至少應該有時(shí)間達到室溫。

    B、動(dòng)物在注射幾天之后死亡

    這可能是由于微生物污染和/或在注射前不久或注射期間激活動(dòng)物造成的。請記住，巨噬細胞的缺失可能導致病毒滴度、細菌或酵母菌的增加。

 

4、脂質(zhì)體標簽如何應用？

    對照脂質(zhì)體可能被標記，例如用熒光染料DiI，因為它們不影響巨噬細胞。因此，該標簽將顯示組織內脂質(zhì)體的分布模式及其被巨噬細胞攝取。我們通常不發(fā)送帶有DiI標記的氯膦酸脂質(zhì)體，原因如下:氯膦酸脂質(zhì)體會(huì )殺死巨噬細胞;因此，一旦巨噬細胞死亡，DiI標簽將被重新輻射，而該標簽不再代表脂質(zhì)體的實(shí)際分布。因此，脂質(zhì)體要么含有氯膦酸鹽來(lái)消耗巨噬細胞，要么含有DiI來(lái)顯示哪些巨噬細胞正在吞噬脂質(zhì)體(或者脂質(zhì)體是否能夠到達待研究的巨噬細胞)。組合可能導致誤解。

 

材料：

PBS:磷酸0012;0,8% NaCl, pH 7,4

 

DiI的解決方案:

將1ml乙醇100%添加到2,5 mg DiI(分子探針文章編號D-3911)在35千赫的水浴中超聲1分鐘(嵴應溶解)

 

方法：

每毫升脂質(zhì)體懸浮液中加入10微升DiI溶液；

*搖動(dòng)脂質(zhì)體懸浮液；

室溫(黑暗)孵育10分鐘；

以20.000 xG離心脂質(zhì)體10分鐘；

移除上層清液；

加入無(wú)菌PBS，復蘇；

以20.000 xG離心脂質(zhì)體10分鐘；

將無(wú)菌PBS添加到原始卷中；

在4攝氏度的溫度下儲存標記為黑色的脂質(zhì)體

 

5、

    A1。大鼠成熟巨噬細胞對ed1和ed2呈陽(yáng)性。然而，它們的前體沒(méi)有表現出吞噬作用(直接離開(kāi)骨髓后)或很少的吞噬作用(在它們擴散到成熟巨噬細胞前不久)也是陽(yáng)性的。這些前驅體對e。2是負的。因此，ed2 +細胞會(huì )*耗盡，但ed1 +細胞只會(huì )部分耗盡。ED1+消耗的百分比取決于前體/成熟巨噬細胞的實(shí)際比例，由于新前體的補充，可能在以后的時(shí)間間隔內發(fā)生改變。

 

6、失敗的表現？

    請注意，氯膦酸酯脂質(zhì)體和對照脂質(zhì)體都是大批量生產(chǎn)的。這些母批得到一個(gè)*的代碼，并檢查氯膦酸鹽的含量和可能的污染后的準備。這些批次的樣品被送往世界各地的幾個(gè)(ca 30)不同的實(shí)驗室。因此，如果我們收到一封電子郵件，報告與脂質(zhì)體缺乏活性或污染有關(guān)的問(wèn)題，我們將檢查是否有其他來(lái)自實(shí)驗室的投訴，這些實(shí)驗室確實(shí)收到了與發(fā)給您的樣品相同批次的樣品。如果沒(méi)有，我們當然會(huì )盡快通知您未來(lái)的投訴將到達我們。

    它們失效的具體地理相關(guān)原因可能是運輸或儲存期間的溫度造成的。脂質(zhì)體在運輸或儲存過(guò)程中，任何時(shí)候都不應冷凍或加熱至攝氏30度以上。

    此外，在選擇給藥途徑時(shí)，應確保脂質(zhì)體能夠暢通無(wú)阻地接近即將耗盡的吞噬細胞(見(jiàn)參考資料一章)。請記住，脂質(zhì)體是顆粒，不會(huì )穿過(guò)正常毛細血管內皮。

    此外，巨噬細胞的特異性標記物也需要從組織中確定它們的消耗。非特異性標記的使用可能影響結果的可靠性。

 

7、如何處理氯膦酸脂質(zhì)體和控制脂質(zhì)體？

    氯膦酸脂質(zhì)體和對照脂質(zhì)體的懸浮液應按原樣使用，不應稀釋或進(jìn)行任何其他處理。如果在到達后的幾天內不使用，可以將其保存在攝氏4度。從未凍結脂質(zhì)體! !

    脂質(zhì)體(作為顆粒)容易沉淀。因此，在將懸浮液分成更小的體積或注射到動(dòng)物體內之前，應輕輕搖動(dòng)懸浮液，以便再次獲得均勻的懸浮液，并使脂質(zhì)體在整個(gè)懸浮液中均勻分布。如果儲存在4攝氏度，脂質(zhì)體應該有機會(huì )達到室溫之前注射。永遠不要注射冷脂質(zhì)體!

 

8、增加氯膦酸脂質(zhì)體的濃度

    A、

    不，氯膦酸鹽在脂質(zhì)體內的水艙中的濃度受氯膦酸鹽溶解度的限制，在標準的氯膦酸鹽脂質(zhì)體懸浮液中保持大濃度。

    B、

    這是不推薦靜脈注射，因為流動(dòng)性會(huì )降低，這可能導致堵塞毛細血管。然而，它也可以嘗試，例如在松散編織的組織中局部注射，或在脂質(zhì)體逐漸進(jìn)入循環(huán)之前從脂質(zhì)體被過(guò)濾的腹腔內注射。

    C、如何確定用量？

    靜脈注射每10克體重不應超過(guò)0.1毫升。然而，腹腔內注射時(shí)，注射量可大大增加。對于皮下注射，大注射量取決于注射部位的儲存能力。

    D、

    Clodronate體內的半衰期是以來(lái)的15分鐘,是很有區別的注射高劑量的免費Clodronate,這將減少到一半的原始值每15分鐘,注射相同劑量的脂質(zhì)體將從死qu的巨噬細胞釋放緩慢。

    在種情況下，有一個(gè)高濃度，將迅速減少。在第二種情況下，濃度要低得多，但可以維持更長(cháng)的時(shí)間。

 

9、巨噬細胞的長(cháng)期消耗

    在正常情況下，即在沒(méi)有某些微生物產(chǎn)物激活的情況下，巨噬細胞群，如肝臟中的庫普弗細胞和脾臟中的紅髓巨噬細胞，在約1周后開(kāi)始重新填充它們的隔室。

    其他巨噬細胞群，如脾臟邊緣嗜金屬巨噬細胞和邊緣區巨噬細胞(靜脈注射后)和淋巴結巨噬細胞(引流區皮下注射后)在較長(cháng)時(shí)間內都不存在(見(jiàn)相關(guān)文獻底稿)。

    為了實(shí)現SCID小鼠巨噬細胞的長(cháng)期耗竭，Fraser等人(Blood, 86;嘗試了幾種注射方案，其中，一次未稀釋的氯丙酸脂質(zhì)體注射后，隨后每5-7天稀釋一次氯丙酸脂質(zhì)體。

    然而，我們應該記住巨噬細胞調節各種非吞噬細胞的功能。因此，它們的長(cháng)期缺失可能終導致功能不活躍，甚至這些非吞噬細胞的消失。

 

10、巨噬細胞前體(單核細胞)

    而靜脈注射Clodronate脂質(zhì)體沒(méi)有成熟的巨噬細胞如腸道,由于脂質(zhì)體不能跨毛細血管的血管內皮,Galeazzi et al . (Am J. Physiol. 278 G259-G265, 2000, 見(jiàn)還在手稿)描述的影響通過(guò)靜脈注射Clodronate脂質(zhì)體的炎癥誘導招聘和滲透F4/80陽(yáng)性細胞的小鼠空腸。關(guān)于這個(gè)問(wèn)題，以下幾點(diǎn)很重要:巨噬細胞(單核細胞)的前體被招募到例如炎癥區域，循環(huán)中的氯膦酸脂質(zhì)體似乎耗盡了。在這種情況下，幾次注射氯膦酸脂質(zhì)體后不久，必須給予對方，因為1。脂質(zhì)體在循環(huán)中存活時(shí)間不長(cháng)。相對于成熟的巨噬細胞，新的單核細胞可以在較短的時(shí)間內被招募。在Galeazzi等人的研究中，給予氯膦酸酯脂質(zhì)體4小時(shí)。在感染前、感染后1、2、4天內，應保證盡可能多地消耗所招募的前體。-顯然，他們得到了大量的，在他們的情況下，也有足夠的損耗，但幾乎*的損耗從來(lái)沒(méi)有報告過(guò)。-在更多的研究中，氯膦酸脂質(zhì)體的作用只能通過(guò)假設在循環(huán)或單核/內皮相互作用水平上對巨噬細胞前體的作用來(lái)解釋。關(guān)于血腦屏障(BBB)，后者的作用可能是通過(guò)將甘露糖殘基摻入含脂質(zhì)體的氯膦酸鹽中來(lái)介導的，Huitinga等(J. Exp. Med. 172; 1025-1033, 1990）描述了甘露醇酯類(lèi)氯膦酸脂質(zhì)體在實(shí)驗性變應性腦脊髓炎(EAE)模型中的作用。——然而在Clodronate脂質(zhì)體的研究多次(每周2次)和靜脈注射給正常小鼠,成熟的巨噬細胞在各種器官血管障礙防止直接進(jìn)入成熟的巨噬細胞,并沒(méi)有耗盡即使在一個(gè)月之后,強調單核細胞維持正常營(yíng)業(yè)額招募巨噬細胞在這些器官,沒(méi)有受到明顯影響。

 

    請同時(shí)參閱新聞部分:

Blood monocytes (the precursors of mature resident macrophages) can be depleted by intravenous injection of Clodronate liposomes.
In: J. Immunol. 2004 Apr 1;172(7):4410-7.
Subpopulations of mouse blood monocytes differ in maturation stage and inflammatory response.
by: Sunderkotter C, Nikolic T, Dillon MJ, Van Rooijen N, Stehling M, Drevets DA, Leenen PJ.

 

11、生產(chǎn)及裝運時(shí)間表？

    訂單在周一、周二和周四發(fā)貨。通過(guò)電子郵件發(fā)送的采購訂單可能需要幾天的時(shí)間來(lái)處理。

    在此之后收到的訂單早將于下周發(fā)貨。盡管我們通常準備的脂質(zhì)體懸浮液比滿(mǎn)足所有要求所需的多一點(diǎn)，但我們每周的生產(chǎn)計劃都是根據這些要求制定的。

    如果你想確定脂質(zhì)體的存在，當你在進(jìn)行中的實(shí)驗中需要這些時(shí)，你應該至少提前兩周訂購。更好的方法是在脂質(zhì)體已經(jīng)儲存在冰箱里的時(shí)候開(kāi)始實(shí)驗。雖然我們通常每周發(fā)貨，但疾病或其他不可預見(jiàn)的情況可能會(huì )打斷這個(gè)過(guò)程!

    如果您的訂單在 2周內沒(méi)有到達，有兩個(gè)主要原因。

1. 該包裹被您的組織拒絕，因為您的名字不為內部分發(fā)郵件的人所知，或者您的地址不完整。

2. 另一個(gè)人已經(jīng)接受了這個(gè)包裹，但沒(méi)有告訴你這件事。如果這種情況不止一次發(fā)生，你的賬戶(hù)就會(huì )被封，直到一切都解決了，因為太多的時(shí)間和材料都因為這些原因被破壞了。