細胞培養的具體操作步驟以及注意事項

　　細胞培養的具體操作步驟以及注意事項
　　細胞培養（cell culture）是指在體外模擬體內環(huán)境（無(wú)菌、適宜溫度、酸堿度和一定營(yíng)養條件等），使之生存、生長(cháng)、繁殖并維持主要結構和功能的一種方法。細胞培養也叫細胞克隆技術(shù)，在生物學(xué)中的正規名詞為細胞培養技術(shù)。
　　不論對于整個(gè)生物工程技術(shù)，還是其中之一的生物克隆技術(shù)來(lái)說(shuō)，細胞培養都是一個(gè)*的過(guò)程，細胞培養本身就是細胞的大規?？寺?。細胞培養技術(shù)可以由一個(gè)細胞經(jīng)過(guò)大量培養成為簡(jiǎn)單的單細胞或極少分化的多細胞，這是克隆技術(shù)*的環(huán)節，而且細胞培養本身就是細胞的克隆。
　　細胞培養技術(shù)是細胞生物學(xué)研究方法中重要和常用技術(shù)，通過(guò)細胞培養既可以獲得大量細胞，又可以借此研究細胞的信號轉導、細胞的合成代謝、細胞的生長(cháng)增殖等。
　　一、細胞復蘇
　　將凍存細胞從液氮中取出后，在37℃水浴鍋內不斷搖動(dòng)促進(jìn)其融化。移人15ml離心管中，加入10ml預熱的DMEM*培養基，輕輕吹勻，離心，2000rpmX2min，棄上清液。
　　加入10ml DMEM培養基清洗，棄上清液。加入10ml DMEM*培養基，輕輕吹打，接種于10cm盤(pán)中，在含5%CO2的細胞培養箱中培養。
　　二、細胞傳代
　　細胞密度達到80%~90%時(shí)．去培養基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶，放人細胞培養箱3min。加人1ml DMEM*培養基終止胰酶消化，轉移至15ml離心管。
　　加入10ml PBS清洗細胞培養盤(pán)，轉移至15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清液。再加入10ml PBS（經(jīng)高壓滅菌，保存于40C），吹勻，吸取10微升進(jìn)行計數，按照1×106/盤(pán)接種，在含5%CO2的細胞培養箱繼續培養。
　　三、細胞凍存
　　細胞密度達到80%～90%時(shí)，去培養基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶，放人細胞培養箱3min。加入lmlDMEM*培養基終止胰酶消化，轉移至15ml離心管。加入10ml PBS清洗細胞培養盤(pán)，轉移至15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清液。
　　加入lml凍存液（90%血清，10%DMSO），放入凍存盒內（盒內有異bing醇，以保證溫度降低的速度），立即放入一80℃冰箱內，過(guò)夜，第二天放入液氮中，可以保存至少兩年，如不放人液氮，可以保存三個(gè)月。
　　凍存液的配制：70%的*培養基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，邊滴邊搖。
　　注意事項
　?。?）進(jìn)入細胞間開(kāi)始細胞培養時(shí)，必須嚴格按照下列步驟操作：
　?、俅_定所有的細胞操作用的溶液和耗材都已經(jīng)消毒并檢測沒(méi)有問(wèn)題，不確定的溶液和耗材請勿使用，除非特殊情況，不要借用別人的溶液。
　?、诖_定衣服的袖口已經(jīng)卷起或者白大褂的袖口已經(jīng)扎緊。
　?、鄞_定酒精燈內的酒精量，需要的話(huà)及時(shí)進(jìn)行補充。
　?、艽_定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。為了方便單手開(kāi)啟瓶蓋，實(shí)驗開(kāi)始前可以把所有瓶蓋旋松。
　?、荼M量不要直接傾倒溶液，除非瓶口沒(méi)有被燒壞。如果傾倒失敗，溶液粘在瓶口，請用噴過(guò)75%酒精的紙巾仔細清潔瓶口周?chē)ú灰佑|到瓶口）后在火焰上簡(jiǎn)單燒灼。
　?、薏僮鲿r(shí)如果不能肯定所用的耗材是潔凈的，必須及時(shí)更換。
　?、邔?shí)驗完畢及時(shí)收拾，保持工作區域清潔整齊，最后用75%酒精清潔臺面。
　?。?）細胞污染的預防
　?、賹?shí)驗用品防止污染。細胞培養所用試劑、耗材、器材的清洗、消毒要*，各種溶液滅菌要仔細，并在無(wú)菌實(shí)驗檢測陰性后才能使用。操作室及剩余的無(wú)菌器材要定期清潔、消毒、滅菌。
　?、诓僮鬟^(guò)程防止污染。
　?、鄞┲?zhù)容易起靜電或吸附灰塵的衣物必須更換為白大褂后才能進(jìn)入細胞間。
　?、軐?shí)驗開(kāi)始前需要確定戴的手套沒(méi)有問(wèn)題，只要接觸過(guò)生物安全柜之外的物品，必須及時(shí)對手套進(jìn)行消毒。
　?、葸M(jìn)入細胞培養間后關(guān)好門(mén)，坐下來(lái)盡量少走動(dòng)以免影響生物安全柜的風(fēng)簾。工作開(kāi)始前要先用75%酒精棉球擦手和瓶蓋。事先要嚴格檢查所用的器材、溶液和細胞，不要把污染品或未經(jīng)消毒的物品帶入無(wú)菌室內，更不能隨便使用，以免造成大規模污染。
　?、藜毎僮鲿r(shí)動(dòng)作要輕，必須在火焰周?chē)鸁o(wú)菌區內打開(kāi)瓶口，并將瓶口放在火焰周?chē)?jiǎn)單轉動(dòng)燒灼，注意不要讓火焰把塑料瓶口燒化。
　?、邔?shí)驗操作時(shí)生物安全柜的隔板要盡可能放低，盡量減少談話(huà)，打噴嚏或咳嗽時(shí)絕對不能對著(zhù)工作區，以免造成不必要的污染。
　?、嗥可w應當倒放在遠離自己的地方，以避免瓶蓋被誤操作所污染。
　?、岵灰獜某ㄩ_(kāi)的容器口上方經(jīng)過(guò)，以避免衣服上掉落不明物體對細胞的污染。
　?、鈱?shí)驗操作時(shí)要注意及時(shí)更換巴斯德吸管、移液槍槍頭和移液管，切勿一根管子做到底。一旦發(fā)現接觸了非潔凈或者無(wú)法確定潔凈的物品必須直接丟棄。實(shí)驗完畢應及時(shí)收拾，保持實(shí)驗室清潔整齊，最后用75%酒精清潔臺面。
　?。?）防止細胞交叉污染
　?、僭谶M(jìn)行多種細胞培養操作時(shí)，所用器具要嚴格區分，作上標記便于辨別。按順序進(jìn)行操作，一次只處理一種細胞，多種細胞多種操作一起進(jìn)行時(shí)易發(fā)生t昆亂。
　?、谠谶M(jìn)行換液或傳代操作時(shí)，粘有細胞的移液槍頭和移液管不要觸及試劑瓶瓶口，以免把細胞帶到培養基中污染其他細胞。
　?、鬯屑毎坏┵徶?，或從別處引入，或自己建立，必須及時(shí)保種凍存，一旦發(fā)生污染可重新復蘇細胞，繼續培養。