想選擇合適的二抗就必須會(huì )這些常識！ 二抗是指用于靶向結合一抗的抗體。在多種免疫印跡、ELISA以及免疫熒光等免疫實(shí)驗中，二抗經(jīng)常和一抗結合使用以檢測目標蛋白。很多二抗都帶有標記物，例如AlexaFluor熒光染料或辣根過(guò)氧化物酶（HRP），從而使二抗的信號可以被檢測到。
實(shí)驗中也可以使用帶有標記物的一抗，但是二抗有很多優(yōu)點(diǎn)。無(wú)論是使用哪種一抗進(jìn)行檢測，使用二抗可便于更換不同的標記物。例如，同樣的一抗可以與HRP標記二抗一起用于免疫印跡，也可以與另一種AlexaFluor488熒光標記二抗一起用于免疫熒光實(shí)驗。
另外，二抗結合在抗原位置的標記染料比直標一抗要多，從而增強檢測信號。使用二抗可以避免對一抗進(jìn)行復雜且昂貴的化學(xué)標記（偶聯(lián)），而且偶聯(lián)反應（具有氨基酸特異性）可能干擾一抗對抗原的識別。
選擇合適的二抗
要選擇出一種適用于您的應用和研究的佳二抗，建議考慮以下因素：
種屬來(lái)源和種屬反應性；特異性反應；純化方法；交叉吸附；多重檢測能力；抗體類(lèi)型和亞型；完整抗體還是抗體片段；標記物；生物素結合蛋白。
01 種屬來(lái)源和種屬反應性
種屬（Host）來(lái)源是指制備這種二抗的物種。常見(jiàn)種屬來(lái)源包括雞、驢、山羊、小鼠、兔、大鼠以及綿羊。因大多數一抗是在小鼠或兔的體內制備的，山羊來(lái)源的抗鼠、抗兔IgG二抗是廣泛的商業(yè)化二抗。
注意：所用二抗的種屬來(lái)源必須不同于一抗的種屬來(lái)源和反應種屬。例如，如果一抗來(lái)源于兔，則不能使用來(lái)源于兔的二抗。
02 特異性反應
區別于一抗的特異性概念（一抗只識別目標蛋白），二抗的特異性指針對一抗的反應特異性，其不僅包括特異識別目標物種（一般經(jīng)交叉吸附），還包括特異識別目標免疫球蛋白（Ig）的類(lèi)型或亞型，以及該二抗是否和抗體的特定部分結合。
常識：如果一抗使用兔多抗，則需要使用抗兔二抗。如果一抗是鼠IgG2b，則二抗需特異識別該亞型。
03 純化方法
動(dòng)物血清或腹水一般經(jīng)四種常見(jiàn)純化方法：親和純化、特異性純化、層析法、脫鹽法。大多數Invitrogen二抗經(jīng)過(guò)親和純化（protein A或protein G），純化后抗體純度能達到95%以上。特異性純化是將抗原固定后進(jìn)行純化的方法，可以保證抗體純度和特異性更高，大多數Invitrogen流式應用的二抗都經(jīng)過(guò)此方法純化。
04 交叉吸附（Cross-Adsorbed）
對二抗進(jìn)行交叉吸附可以幫助去除來(lái)源于非目標抗體和蛋白的交叉反應性，從而提高抗體的特異性。交叉吸附是指將親和純化的二抗通過(guò)一個(gè)固定有其它種屬來(lái)源的抗體或血清蛋白的純化柱。能夠識別這些其它種屬來(lái)源的抗體或血清蛋白的二抗將結合在純化柱上，通過(guò)這種方法可以獲得交叉反應性更低的二抗，從而降低背景和提升抗體效價(jià)。
